Studio e valutazione della cancerogenesi

La cancerogenesi la si studia con diverse prove tossicologiche standardizzate. Una prima parte di queste prove viene effettuata in vitro, e - qualora risultassero positive - si procede con una sperimentazione in vivo. Questo approccio sperimentale a tappe viene chiamato DECISION POINT APPROACH, una sequenza di prove che si fermano alla fine di ogni prova per decidere come procedere con la sperimentazione. Le tappe sono cinque:

FASE A: struttura e caratteristiche del composto cancerogeno;

FASEB: in questa fase di test a breve termine in vitro, si impiegano delle cellule di mammifero. Le cellule maggiormente impiegate sono gli epatociti, perché si va a studiare l'entità della riparazione al danno che l'epatocita sviluppa a seconda della gravità del danno provocato dalla sostanza. In poche parole si va a determinare non il danno di per sé, ma quanto sistema di riparazione è stato attivato dalla cellula del fegato.

La procedura attuata è di formare 3 colture di epatociti. Nella prima coltura gli epatociti sono sani, nella seconda sono trattati con la sostanza in esame ed infine nella terza sono trattati con una sostanza di controllo sicuramente cancerogena. Queste tre colture contengono una base pirimidinica radioattiva, che è la timidina triziata, che funge da marcatore.

Se il composto in esame va a provocare una mutazione a livello del DNA la cellula risponde a questo problema attivando i sistemi di riparazione. Il pezzo di DNA che ha subìto la mutazione viene tagliato e grazia all'azione della DNApolimerasi il pezzo mancante viene sostituito con uno nuovo. Per la correzione, la DNApolimerasi usufruisce delle nuove basi, tra cui la timidina triziata. Pertanto nella zona di taglio viene incorporata una base radioattiva. Dall'analisi della radioattività si va a stabilire il livello di mutazione nelle cellule trattate: tanto più elevata risulta la radioattività e tanto maggiori sono state mutazioni a livello del DNA.

Sempre nella fase B si eseguono test anche sui batteri, per riuscire a studiare se ci sono delle retromutazioni. I batteri impiegati sono delle salmonelle già portatrici di mutazioni. La mutazione riguarda la sintesi dell'istidina, quindi le salmonelle non sono in grado di crescere senza l'istidina. Queste colonie batteriche vengono prese in parte per essere trattate con la sostanza in esame, in parte per il controllo negativo ed in parte per il controllo positivo, quindi testate con un cancerogeno noto. Se questa sostanza in esame è un genotossico indiretto si deve immettere nel terreno di coltura degli enzimi metabolizzanti. A questo punto si hanno 3 colture che verranno seminate e coltivate in piastre petri (non c'è istidina nel terreno di coltura). Se non ci sono state delle mutazioni da parte del cancerogeno da testare, sulle piastre in teoria non ci dovrebbe essere nessuna crescita. Se c'è stata un'azione mutagena del cancerogeno, questa può aver modificato la prima mutazione e aver creato una seconda mutazione in grado di far crescere i batteri sul terreno di coltura privo di istidina. In questo caso, la seconda mutazione che va a modificare la prima mutazione prende il nome di RETROMUTAZIONE. Infine, se nella piasta petri si verifica una crescita notevole il cancerogeno è diretto.
Sempre con un test in vitro si riesce a determinare l'integrità cromosomica. Questo test viene sempre effettuato su cellule di mammiferi e serve per testare sostanze tossiche in grado di provocare mutazioni su alcuni enzimi responsabili della biosintesi del DNA. La sostanza da testare viene sottoposta ad analisi in vitro. Per riuscire a determinare se la sostanza in esame va ad agire sull'integrità e sul numero dei cromosomi presenti si utilizza il test dei micronuclei. I micronuclei sono delle vescicole che si formano con all'interno una parte della cromatina. La cromatina inglobata in questi micronuclei potrebbe essere o cromosomi intero o frammenti di cromosomi. I micronuclei si formano dalla errata divisione cellulare dando origine a cellule figlie con materiale genetico non equamente ripartito. Il risultato di questo test sarà la determinazione di sostanze che vengono definite clastogene e veleni del fuso. La sostanza clastogena produce dei micronuclei con frammenti acentrici di cromosomi quindi la sostanza induce ad una rottura dei cromosomi, invece la sostanza veleno del fuso produce dei micronuclei che al suo interno sono presenti cromosomi interi.
Se la sostanza presa in esame induce genotossicità in uno o più test questa viene definita altamente sospetta, quindi si passa direttamente alla fase D. Se invece la sostanza testata non produce nessun effetto genotossico si passa alla fase di studio C perché può essere un promotore.

FASEC: in questa fase si possono effettuare sia dei test in vitro che in vivo.

Per i test in vitro si potrebbe dimostrare la possibilità della sostanza con effetto promotore di rompere le gap-junction tra le cellule normali e le cellule tumorali, con conseguente passaggio di sostanze tra le due cellule.

Un test in vivo è quello di induzione di tumori cutanei nel topo. La sostanza da testare viene applicata due o tre volte in una settimana sulla cute del topo. Nel giro di 2/3 mesi se questa sostanza è un promotore ci possono essere delle formazioni di papillomi. Nei topi vengono considerati due principali dati: il numero di topi affetti da papillomi e il numero di papillomi presenti su ogni animale. Se la sostanza si comporta da promotore e sviluppa un tumore nel topo trattato signiifica che è effettivamente una sostanza con effetto promotore.

Terminati questi test si passa alle prove in vivo a lungo termine.

FASED: in questa fase vengono testati tutti i composti che si dimostrano mutageni e tutti i composti che non si dimostrano mutageni. I test che si possono eseguire sono diversi, alcuni dei quali sono test eseguiti sul fegato, sul polmone ed infine sulla mammella.

Il test sul fegato dimostra la formazione non di un tumore neoformato, ma di un focus neoplastico, quindi un qualcosa che si prepara a diventare tumore. Le cellule di questo focus sono già cellule atipiche, quindi che hanno subìto una mutazione e si preparano a diventare cellule neoplastiche. Dopo un certo tempo, grazie all'esame autoptico, si va a determinare la formazione di focus pre-neoplastici, andando a calcolare il numero e l'estensione di queste formazioni pre-neoplastiche.

Il test sul polmone permette la determinazione di un adenoma, che è un'anomalia delle cellule del tessuto polmonare. Anche in questo caso si va a vedere dopo un tempo abbastanza lungo (mesi) il tessuto polmonare del ratto (questi adenomi sono facilmente identificabili perché sono dei noduli biancastri sull'epitelio polmonare).
Il test sulla mammella permette la determinazione di tumori a livello del tessuto ghiandolare. Si va sempre a valutare il numero di adenomi formati e il numero di animali che presentano adenomi.

Se ci sono dei risultati positivi da questi test la sostanza in esame è veramente una sostanza cancerogena. A questo punto si passa alla conduzione di test costosi e con tempi di esecuzione molto lunghi.

FASEE: in questa fase viene sottoposto a test a lungo termine un numero variabile di animali, da 20 a 50. Questi test sono molto costosi e richiedono molto tempo prima di avere dei risultati certi; si parla di circa 1/8 della vita dell'animale. È possibile che durante l'iter di questi test alcuni animali muoiano, ma vengono sempre studiati con un esame di tipo autoptico e di tipo istologico. Gli animali scelti sono sempre ratti e topi e solo il 70-80% sopravvive fino alla fine dei test a lungo termine. Gli animali impiegati sono appena svezzati, in quanto più sono giovani e più sono sensibili ai trattamenti. Durante il periodo di test a lungo termine il ricercatore è sempre affiancato da un matematico-statista, in grado di tener conto di tutte le informazioni raccolte e di riprodurre i vari dati.

Le dosi testate sugli animali partono dalla dose massima tollerata e tutti i suoi sottomultipli, e si valuta la reazione dose-risposta nell'animale.
La somministrazione deve avvicinarsi sempre alla via attraverso cui l'uomo può venir a contatto con la sostanza in esame, quindi la via orale, cutanea o respiratoria, mentre se si testa la cancerogenicità di un farmaco è utile eseguire anche la somministrazione intravenosa.
I gruppi di animali testati sono 4 (50 animali per ogni gruppo):

• Un gruppo NAIF che non ha nessun trattamento;
• Un gruppo trattato con il veicolo;
• Un gruppo trattato con la sostanza in esame;
• Un gruppo trattato con un cancerogeno noto.

E' molto importante che il numero degli animali di ogni gruppo sia il più possibile uguale. Infatti, se c'è roppa differenza nel numero degli animali il test statistico può rivelarsi fasullo.
Le valutazioni che si vanno ad effettuare sono:

• Frequenza totale dei tumori;
• Frequenza di alcuni tumori;
• Frequenza di animali con più di un tipo di tumore;
• Numero di tumori per animali.

Al temine di tutte queste fasi di studio, la sostanza viene classificata in una graduatoria stabilita dalla IARC (agenzia internazionale per la ricerca e sviluppo sul cancro) e dell'ente di protezione ambientale (EPA).